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Não existe nenhum documento que permita confirmar o lugar ou a data de nascimento de Buxtehude, e mesmo sua nacionalidade é assunto de controvérsia. A única informação contemporânea nos vem de uma nota publicada do "Nova Literia Maris Balthici", pouco tempo após sua morte:

"Ele reconheceu a Dinamarca como sua terra nativa, visto que se estabeleceu em nossa região; viveu aqui aproximadamente 70 anos."

Embora sua família fosse originária da cidade de Buxtehude, no sudoeste de Hamburgo, seus antepassados se estabeleceram, no início do século XVI, em Oldesloe, no Ducado de Holstein. Seu pai, Johannes (1602-1674), era organista e mestre-escola e sua presença em Oldesloe é documentada até 1638, quando se mudou para Helsingborg, no distrito de Scania (agora Halsingborg, Suécia), para tornar-se organista da igreja Marienkirche. Tanto Holstein como a Scania estavam, neste tempo, sob o controle dinamarquês. Um pouco mais tarde em 1641 ou em 1642, muda-se para Helsingor, na Dinamarca, para assumir o posto de organista na igreja de Olaikirche, uma posição que ocupou até sua aposentadoria em 1671.

Dietrich Buxtehude estudou provavelmente na Lateinschule de Helsingor e recebeu, de seu pai, sua instrução musical. Em 1657 ou em 1658, torna-se organista da antiga igreja de seu pai em Helsingborg e, em 1660, vai para Helsingor, uma comunidade da língua alemã, como organista da igreja Marienkirche. Na altura da morte de Franz Tunder, em 5 de novembro de 1667, o cargo de organista da igreja Marienkirche de Lübeck, uma das posições mais prestigiosas do norte da Alemanha, torna-se vago. Depois de diversos outros organistas tentarem obter o posto, mas não sendo mantidos, Buxtehude foi selecionado em 11 de abril de 1668. Ao mesmo tempo, é nomeado Werkmeister, uma posição que incluía as tarefas de secretário, tesoureiro e agente administrativo da igreja; esta colocação, compreendendo um salário à parte, normalmente era confiada ao organista. Buxtehude torna-se cidadão de Lübek em 23 de julho de 1668 e, alguns dias mais tarde, em 3 de agosto de 1668, casa-se com Anna Margarethe Tunder, filha de seu predecessor. Não está absolutamente certo de que esta união tenha sido uma condição para a assunção ao cargo, como será o caso com seu sucessor, mas este hábito não era incomum nestas épocas. A filha mais velha, Augusta Sophie, já havia casado com o Kantor da igreja, Samuel Franck. O pai de Buxtehude juntou-se a ele em Lübek em 1673 e seu irmão, Peter, um barbeiro, seguiu-o em 1677.

As tarefas principais de Buxtehude consistiram em tocar no serviço principal diário, no serviço da tarde de domingo e dos dias de festa, bem como nas Vésperas diariamente. Além de executar os prelúdios usuais para os corais da comunidade e os cantos do coro, Buxtehude tocava durante a comunhão, e aqui freqüentemente com a participação dos instrumentistas ou dos cantores, ou ambos, remunerados pela igreja. Uma parte de sua fama, entretanto, repousa sobre uma atividade que estava fora de suas funções oficiais na igreja: pouco após sua chegada em Lübek, reativou a série de concertos dados na igreja, chamados "Abendmusik", programados por Thunder em uma manhã por semana, mas Buxtehude passou-os para imediatamente depois do serviço vespertino, em cinco domingos por ano – os dois que se seguiam à festa da Trindade e o segundo, terceiro e quarto do Advento. Nenhuma composição que pudesse ter sido executada nestes concertos sobreviveu, ainda que quase certamente algumas de suas peças vocais devam ter sido usadas.

Buxtehude cumpriu fielmente suas tarefas para com a igreja de Marienkirche durante quase 40 anos. A única referência quanto às suas viagens é uma visita em Hamburgo, em 1687, para examinar lá um órgão de Schnitger instalado recentemente na igreja de Nikolaikirche. Estava em contato, de uma maneira ou outra, com os principais outros músicos alemães de seu tempo. Era amigo da família Duben de Estocolmo. É à vasta coleção de manuscritos de música sacra de Gustaf Duben que se deve a conservação de quase toda a música vocal de Buxtehude. É também a fonte para as obras de Kaspar Forster, que Buxtehude parece ter conhecido pessoalmente ou através de Duben. Sua amizade, em Lübek, com Johann Theile é atestada por um poema composto para a Paixão de Cristo que Theile publicou em 1673. De acordo com Mattheson, Theile ensinou Buxtehude mas é mais provável que os dois músicos considerassem a si mesmos como colegas. Os poemas de Buxtehude foram publicados também no “Harmonologia musica” (1702) de Andreas Werckmeister. Foi também Werckmeister que transmitiu a J.G. Walther diversas das composições para órgão de Buxtehude, cujas cópias ainda existem.

Entre a geração mais nova de organistas, Nicolaus Bruhns era seu aluno, e Pachelbel dedicou-lhe seu "Hexachordum Apollonis" (1699). Mattheson e Haendel visitaram-no, em Lübek, em 17 de agosto de 1703. Mattheson, considerado como seu possível sucessor, declinou da oferta quando soube da imposição de casamento embutida no contrato. A documentação a respeito da famosa viagem de Bach a Lübek consta no relatório do Consistório de Arnstadt, de 21 de fevereiro de 1706, onde que se lê como "foi a Lübek aprender lá das coisas a respeito de sua arte" e que pediu uma permissão para uma ausência de quatro semanas, mas permaneceu lá por um tempo aproximadamente quatro vezes maior. Estava lá provavelmente para as Abendmusik extraordinárias que comemoraram a morte do imperador Leopold I e a ascensão de Joseph I, entre 2 e 3 dezembro de 1705. Está claro, pelo obituário de Bach, que o objetivo de sua visita era ouvir Buxtehude ao órgão.